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外顯子組測序（ES）：革命性的診斷工具在單基因疾病中的應(yīng)用和快速外顯子組測序（RES）的重要性

單基因（孟德爾）疾病是一種高度多樣化的疾病，可以影響身體的任何器官，雖然個體罕見，但總體上相對常見。因此，即使是經(jīng)驗豐富的臨床醫(yī)師，在沒有既往臨床經(jīng)驗的情況下，也很可能在執(zhí)業(yè)過程中遇到其中一些疾病。在一些環(huán)境中，如新生兒和兒科重癥監(jiān)護(hù)病房，特別容易出現(xiàn)單基因疾病的聚集。過去，診斷這些疾病一直是具有挑戰(zhàn)性的工作，即使成功，也可能需要數(shù)年時間。然而，外顯子組測序（ES）的出現(xiàn)徹底改變了這種情況，它突破了準(zhǔn)確臨床診斷的先決條件。事實上，現(xiàn)在即使臨床醫(yī)師無法準(zhǔn)確識別臨床診斷結(jié)果，也可以通過外顯子組測序（ES）來診斷單基因疾病。

雖然大多數(shù)單基因病沒有特異性療法，但并不意味著分子診斷不能為重要的治療選擇提供指導(dǎo)，而且分子診斷還可以幫助避免無效或有害的干預(yù)措施。由于這類疾病大多罕見，才更加凸顯分子診斷的價值。分子診斷不僅可以建立關(guān)于疾病自然史的必要知識庫，制定監(jiān)測指南，與患者及其家人共享數(shù)據(jù)驅(qū)動的預(yù)后信息。而且只有在獲得分子診斷的情況下，才能準(zhǔn)確地進(jìn)行復(fù)發(fā)風(fēng)險計算，這對生殖計劃至關(guān)重要。這些臨床應(yīng)用的重要性促使美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會（ACMG）認(rèn)可外顯子組測序（ES）作為一級檢測，用于具有挑戰(zhàn)性的單基因疾病（如多發(fā)性先天性畸形和發(fā)育遲緩）的患者。

快速外顯子組測序(RES)是一種特殊類型的外顯子組測序（ES），其中從樣本接收到報告生成的整個流程被壓縮到幾小時或幾天，而不是常規(guī)臨床外顯子組測序（ES）的典型幾周或幾個月。快速外顯子組測序(RES)的資源密集性質(zhì)通常在某些臨床情況下是合理的，在這些情況下，快速分子診斷被認(rèn)為可以為急性臨床管理決策提供信息。自2012年開始使用快速基因組測序（RGS）以來，在重癥監(jiān)護(hù)病房（新生兒和兒科）中展示了其重要價值，從最初的先鋒性故事逐漸發(fā)展為隨機(jī)病例對照研究，清楚地證明了該方法在臨床上的實用性。然而這些研究主要是在親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的人群中開展的，所以我們迫切需要在親緣關(guān)系較近的人群中測試快速基因組測序（RGS）的分析效果。之前我們已經(jīng)有了在高度親緣關(guān)系的人群中使用快速基因組測序（RGS）的初步經(jīng)驗，現(xiàn)在我們將新病例樣本規(guī)模擴(kuò)大到了189個，并重點研究了該方法的臨床診斷效果。

快速外顯子組測序（RES）：為緊急臨床診斷提供幫助的可行研究方案

所有臨床小組都被告知快速基因組測序（RES）是一種可行的研究方案，可以為需要緊急分子診斷的患者提供幫助。我們鼓勵臨床醫(yī)生與研究團(tuán)隊（FSA）代表聯(lián)系，提供病例信息。病例經(jīng)過同一研究代表的評估，以便確保一致性。

本研究只納入具有合理理由需要進(jìn)行快速非常規(guī)分子診斷的病例。符合條件的病例包括：

（a）需要在達(dá)到法定截止日期(受孕后120天，即妊娠18.5周)前4周內(nèi)做出終止妊娠決定的產(chǎn)前病例；

（b）重癥監(jiān)護(hù)病房（通常是新生兒或兒科）的病例，診斷不明確，需要準(zhǔn)確診斷指導(dǎo)積極治療或改變現(xiàn)有治療方案；

（c）需要緊急決定是否適合進(jìn)行肝或骨髓移植的病例。在開始采樣之前，我們獲得了所有參與者的知情同意，采樣通常是通過采集靜脈血樣本（使用EDTA管）進(jìn)行的。有時也會采集唾液樣本，例如在白細(xì)胞減少癥情況下，產(chǎn)前病例使用羊水進(jìn)行采樣。本研究已經(jīng)得到當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會的批準(zhǔn)。

臨床醫(yī)生調(diào)查揭示：遺傳病結(jié)果具有多領(lǐng)域的陽性臨床效用

我們向臨床醫(yī)生進(jìn)行了調(diào)查，并詢問了他們對結(jié)果的臨床效用的投入。我們使用了與Dimmock等人相同的四個領(lǐng)域進(jìn)行評估：

第1類：患者管理和臨床結(jié)局方面的變化：我們觀察到患者在急性狀況管理或臨床治療中出現(xiàn)了明顯的變化。這包括篩查可能有遺傳病并發(fā)癥的患者、提供新的專科咨詢、改變藥物治療方案、進(jìn)行有創(chuàng)性手術(shù)的決策變化（例如移植或終止手術(shù)）、改變飲食方案、影像學(xué)檢查的變化以及姑息治療。我們通過評估是否成功使用了針對特定遺傳疾病的靶向治療、避免了并發(fā)癥的發(fā)生以及提升了姑息治療的質(zhì)量來評估患者的臨床結(jié)局變化。

第2類：溝通方面的變化：我們觀察到與患者家屬進(jìn)行溝通時發(fā)生了變化。這包括對患者的結(jié)局、期望和預(yù)后進(jìn)行更詳細(xì)的溝通和解釋。

第3類：后續(xù)檢查順序的變化：我們觀察到由于我們的結(jié)果，醫(yī)生可能會觸發(fā)額外的確證性檢查。這些額外的檢查是為了進(jìn)一步確認(rèn)診斷或檢測可能的并發(fā)癥情況。

第4類：其他治療變化：我們觀察到醫(yī)生可能會對進(jìn)一步的咨詢、監(jiān)測或研究提出不同的治療方案。

根據(jù)我們向臨床醫(yī)生的調(diào)查，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)結(jié)果可以引起急性患者管理或臨床結(jié)局方面的變化，或者當(dāng)結(jié)果能夠促進(jìn)患者與家屬的溝通，亦或者當(dāng)結(jié)果導(dǎo)致額外的檢查以及當(dāng)結(jié)果引起其它治療方面的變化時，這些結(jié)果具有陽性臨床效用。

全新研究揭示：189例未發(fā)表的遺傳病例中的突變分析與診斷關(guān)聯(lián)

該研究包含189例尚未在任何學(xué)術(shù)出版物或醫(yī)學(xué)期刊上發(fā)表的病例。這些病例的年齡范圍從胎兒到40歲（不包括為推斷死亡兒童的病因而接受檢測的父母）。在這些病例中，有91名女性和101名男性。其中重癥監(jiān)護(hù)病房占比53%，進(jìn)行這些病例檢測的原因包括：

（a）其中67例屬于急性ICU管理指導(dǎo)；

（b）關(guān)于移植（肝臟或骨髓移植）的緊急決定問題共有90例；

（c）產(chǎn)前決定共有9例，以及其它原因合計有23例。

在總共82個突變中有80例發(fā)現(xiàn)了陽性結(jié)果。這些突變跨越67個基因，13個是新基因，47個預(yù)測功能喪失(LOF)。80例陽性結(jié)果中有69個是常染色體隱性遺傳，除去了2個非純合子的情況，其余67例均為純合子。

揭示新的基因-疾病關(guān)聯(lián)：豐富遺傳疾病的理解和診療指導(dǎo)

接下來，我們要講的這兩個案例研究講述了新的基因-疾病關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步豐富了我們對相關(guān)基因的認(rèn)識，并為相關(guān)疾病的診斷和治療提供了指導(dǎo)。

第一個案例是SCYL1基因與CALFAN綜合征的相關(guān)性。在OMIM數(shù)據(jù)庫中，SCYL1僅被列為自體隱性遺傳的CCA1型脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)。然而，Lenz等人報道了一種名為CALFAN綜合征的新型SCYL1基因相關(guān)表型。患者Pat-1006表現(xiàn)為急性肝功能衰竭和腦病，并發(fā)現(xiàn)其具有純合子剪接突變，支持了這種關(guān)聯(lián)。

第二個案例是GALE基因的突變與血小板減少癥的相關(guān)性。GALE基因編碼UDP半乳糖-4-表達(dá)酶，其缺乏已知會導(dǎo)致半乳糖血癥。令人驚訝的是，一種奠基者突變被發(fā)現(xiàn)引起了一種僅限于血小板減少癥的不同表型。患者Pat-1039表現(xiàn)為血小板減少癥、免疫性溶血性貧血、IgA和IgM降低以及反復(fù)感染，需要緊急決定進(jìn)行骨髓移植。發(fā)現(xiàn)他純合子攜帶了相同的奠基者突變。因此，他的表型既證實又?jǐn)U展了與GALE相關(guān)的這種不同表型。

Pat-1001是一個胎兒，患有胎兒運動無力癥。在進(jìn)行快速基因組測序（RES）檢測時，發(fā)現(xiàn)他攜帶COL25A1基因的純合子截斷突變。在OMIM數(shù)據(jù)庫中，COL25A1僅列出了一個僅涉及眼部的表型（先天性眼外肌纖維化5型）。在編寫本文稿過程中，我們意識到還有其他的COL25A1相關(guān)胎兒運動無力癥的病例（正在提交修訂版文稿）。因此，這代表了一個具有臨床意義的表型擴(kuò)展。

簡而言之，這意味著COL25A1基因的突變不僅僅會導(dǎo)致眼部問題，還可能涉及其他肌肉的普遍運動無力癥狀。這個新的發(fā)現(xiàn)對于我們理解該基因的作用以及相關(guān)疾病的診斷和治療具有重要意義。

意想不到的診斷結(jié)果：全外顯子測序揭示潛在遺傳性疾病的關(guān)鍵

患者Pat-1192是一個7歲的孩子，考慮將其作為一個緊急骨髓移植的候選人，用于治療患有再生障礙性貧血的兄弟姐妹。對其兄弟姐妹進(jìn)行了快速外顯子組測序(RES)檢測，以診斷再生障礙性貧血的病因，并排除兄弟姐妹（潛在的供體）的可能性。令人驚訝的是，雖然沒有找到再生障礙性貧血的原因，但發(fā)現(xiàn)兄弟姐妹Pat-1055攜帶了一個致病性ATM基因突變，從而確立了遺傳性小腦萎縮血管擴(kuò)張癥的臨床未被懷疑的診斷，并排除了作為供體的可能性。

同樣，患有青紫心臟病的患者Pat-1098出現(xiàn)了反復(fù)溶血危機(jī)，但沒有明確的病因。發(fā)現(xiàn)一個致病性G6PD基因突變令人驚訝，因為先前的檢測顯示G6PD水平正常。后來發(fā)現(xiàn)，這些水平是在輸血后太早測量的，無法真實反映內(nèi)源性酶活性。另一個例子是患者Pat-1160，他表現(xiàn)出血吞噬淋巴組織細(xì)胞增多癥（HLH）的特征，并有一個嬰兒時期因類似癥狀而死亡的兄弟姐妹。令人意外的是，發(fā)現(xiàn)這位患者攜帶了GNS基因的純合致病性突變。目前尚不清楚這一發(fā)現(xiàn)與主要病癥是否有關(guān)。

簡而言之，這些案例展示了一些意想不到的診斷結(jié)果，豐富了我們對疾病的理解。它們強(qiáng)調(diào)了進(jìn)行全外顯子測序的重要性，以揭示潛在的遺傳性疾病和相關(guān)病因，為患者的診斷和治療提供指導(dǎo)。

快速外顯子組測序（RES）：關(guān)鍵的臨床管理工具，改善患者的預(yù)后和避免無效治療

在許多病例中，通過快速基因組測序（RES）獲得的診斷結(jié)果對患者的臨床管理產(chǎn)生了顯著影響。

例如，患者Pat-1057表現(xiàn)出急性肝衰竭，但經(jīng)過特殊的半乳糖血癥飲食管理后，癥狀完全消失。令人遺憾的是，新生兒篩查沒有檢測出這一診斷。

另一個例子是患者Pat-1088，在發(fā)現(xiàn)他攜帶純合子TCN2基因突變引起的鈷胺素缺乏后，他表現(xiàn)出全血細(xì)胞減少癥、骨髓異常增生綜合征、外周血中5%原始細(xì)胞、輕度發(fā)育遲緩、皮膚色素沉著異常和腸梗阻。然而，在對他進(jìn)行羥基鈷胺素注射后，他的臨床狀況有了顯著的改善。

還有患者Pat-1106，在補(bǔ)充鳥氨酸并限制蛋白質(zhì)攝入后，他的癥狀完全恢復(fù)。經(jīng)過進(jìn)一步檢查發(fā)現(xiàn)，他患有高鳥氨酸血癥-高氨血癥-同型瓜氨酸血癥綜合征，該綜合征與slc25a15基因相關(guān)。

當(dāng)PICU團(tuán)隊告知患者Pat-1132的父母，他的病情非常嚴(yán)重，患有進(jìn)行性肌無力、延髓麻痹和呼吸衰竭，預(yù)后不太樂觀時，他們差不多決定放棄進(jìn)行復(fù)蘇（DNR）措施。然而，在發(fā)現(xiàn)了與slc52a3基因相關(guān)的核黃素轉(zhuǎn)運體缺陷后，立即給予核黃素治療，患者的臨床狀況迅速顯著改善，且目前正在門診隨訪中。

需要注意的是，雖然SLC52A3和TCN2基因突變?nèi)员徽J(rèn)為是不確定意義的突變（VUS），但我們選擇這些例子，是因為最近的研究提倡根據(jù)預(yù)期的治療反應(yīng)來進(jìn)行診斷和治療的決策。

總之，這些案例突出了快速基因組測序（RES）在診斷和治療中的重要性，為醫(yī)生提供了寶貴的指導(dǎo)和決策依據(jù)，以改善患者的臨床狀況。

有一些患者在接受快速基因組測序后發(fā)現(xiàn)了一些不確定意義的突變（VUS）。例如，Pat-1142患有mthfr相關(guān)同型半胱氨酸尿，出現(xiàn)了快速認(rèn)知功能下降，還有廣泛的腦血管病變和身體內(nèi)的血栓形成。然而，在適當(dāng)?shù)闹委熛拢摶颊呷〉昧孙@著的臨床改善。

另外，有一些分子診斷導(dǎo)致了無效治療的停止。例如，患有plce1相關(guān)腎病綜合征的患者Pat-1117停止了類固醇和免疫抑制劑治療，并接受了腎移植，因為分子診斷表明這些治療對其無效。而患有kcnj11相關(guān)先天性高胰島素血癥的患者Pat-1119停用了二氮嗪藥物，而選擇接受胰腺切除手術(shù)，取得了良好的效果。另外，患有神經(jīng)鞘瘤病的患者Pat-1146經(jīng)過基因測序發(fā)現(xiàn)其病因是神經(jīng)鞘瘤病而非nf1相關(guān)的神經(jīng)纖維瘤病，因此避免使用了selumetinib藥物。

這些案例突出了快速基因組測序在改善患者的臨床狀況方面的重要性，為醫(yī)生提供了指導(dǎo)，并避免了無效治療的發(fā)生。

快速外顯子組測序（RES）：為患者提供確切的診斷標(biāo)簽和疾病預(yù)后信息

在大多數(shù)情況下，臨床醫(yī)生非常高興能夠在進(jìn)行基因組測序之前給患者一個確切且無疑義的診斷標(biāo)簽。他們可以向患者解釋疾病的自然發(fā)展過程，并提供有關(guān)疾病預(yù)后的相關(guān)信息。這使得患者和其家屬更清楚地了解病情，并知道可能會發(fā)生什么。

分子診斷：確認(rèn)診斷的關(guān)鍵工具而非引發(fā)更多檢查的來源

根據(jù)數(shù)據(jù)，分子診斷只觸發(fā)了很少一部分的確證性檢查，這并不包括與并發(fā)癥或其他疾病特征相關(guān)的篩查。換句話說，大部分情況下，分子診斷并沒有引發(fā)更多的確診性檢查，而是更多地用于確認(rèn)已有的診斷。

多致病突變的遺傳疾病：復(fù)雜風(fēng)險評估與生殖咨詢的重要性

在絕大多數(shù)陽性病例中，致病性突變是以常染色體隱性遺傳方式傳遞的。這意味著可以向患者的父母提供生殖咨詢，例如胚胎植入前遺傳學(xué)檢測或產(chǎn)前診斷，以確保未來孩子的健康。

然而，在有些情況下，發(fā)現(xiàn)多個致病突變使得復(fù)發(fā)風(fēng)險變得更加復(fù)雜。例如，患者Pat-1000在懷孕期間發(fā)現(xiàn)了致病性FARS2突變，而另一個已故兒童則有不同的表型（嚴(yán)重低張力），并被發(fā)現(xiàn)攜帶家族性FARS2突變。為了確定風(fēng)險，需要對這對夫婦以及另一個已故孩子的DNA樣本進(jìn)行更詳細(xì)的遺傳學(xué)檢測。結(jié)果顯示了LMOD3和BRCA2基因的純合子突變，最終確診為桿狀體肌病。

在這種情況下，復(fù)發(fā)風(fēng)險從1/4 提高到了7/16，并向夫婦提供了產(chǎn)前診斷的選擇。如果是常染色體顯性突變，并且已經(jīng)確認(rèn)新生兒的狀態(tài)，則可能需要對父母進(jìn)行檢測，以了解最小遺傳風(fēng)險，并討論親代嵌合的可能性。在本研究中，只有一名患者（Pat-1052）觀察到多位點致病突變，該患者攜帶了BRCA2和DCAF17基因的純合子突變。這表明疾病的發(fā)病可能涉及多個基因。需要強(qiáng)調(diào)的是，我們在統(tǒng)計這些數(shù)據(jù)時僅考慮了所有突變均可能致病的情況。

快速外顯子組測序（RES）：為罕見疾病診斷帶來巨大成本節(jié)省

根據(jù)我們的研究結(jié)果，每個樣本的快速基因組測序（RES）費用為2000美元。根據(jù)這個價格，這189個病例的總診斷費用為37.8萬美元。

18歲以下的罕見疾病患者平均年醫(yī)療費用為80,436美元。在我們的研究中，接受治療的患者平均年齡約為3歲。因此，我們估計這189名患者的每年治療費用為1520.2404萬美元。診斷費用占到總年度費用的2.48%。

特別是，在研究中有26例陽性病例需要進(jìn)行骨髓移植或肝臟移植，手術(shù)的總成本為1462.8萬美元。快速基因組測序（RES）診斷費用占到總年度治療和手術(shù)費用的1.27%。

快速基因組測序（RES）的結(jié)果促使80例病例接受生殖咨詢，每個病例都有可能阻止未來一個或多個患病嬰兒的出生。根據(jù)保守估計，這80例病例將阻止25%的兄弟姐妹患病，從而每年節(jié)省160.872萬美元的醫(yī)療費用，乘以平均年壽命。同樣，快速基因組測序（RES）的結(jié)果改變了9例患者的治療方法，避免了昂貴和禁忌的移植手術(shù)（6例肝臟移植和3例骨髓移植），節(jié)省了252.6萬美元。

此外，快速基因組測序（RES）的結(jié)果將3例重癥監(jiān)護(hù)室患者的治療轉(zhuǎn)為姑息護(hù)理和不復(fù)蘇狀態(tài)，節(jié)省了19.867萬美元的費用。假設(shè)這些患者平均在重癥監(jiān)護(hù)室停留30天，僅僅從這個群體中，快速基因組測序（RES）就能夠節(jié)省超過433.339萬美元的醫(yī)療保健成本，這意味著至少節(jié)省了395.539萬美元。

快速基因組測序的臨床效用和經(jīng)濟(jì)價值：親緣關(guān)系較近婚配人群的特殊機(jī)會和測序技術(shù)的考慮

自從2012年首次引入以來，快速基因組測序或快速外顯子組測序因其在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中具有潛在的高診斷效果，受到越來越多的關(guān)注。它可以降低成本，改善資源利用，已經(jīng)得到證明，并且在家長滿意度方面得分較高。重要的是，多個研究小組已經(jīng)證明了其臨床效用，通常應(yīng)用于新生兒和小兒ICU。同樣，我們需要堅實的數(shù)據(jù)來證明快速基因組測序或快速外顯子組測序的臨床效用，以合理地覆蓋這種比傳統(tǒng)外顯子組測序成本更高的特殊工作流程。這些數(shù)據(jù)應(yīng)該包括不同的環(huán)境，包括親緣關(guān)系較近婚配人群，這在快速基因組測序或快速外顯子組測序的臨床有效性研究中很大程度上是缺乏的。

親緣關(guān)系較近婚配人群的自交性增加了發(fā)現(xiàn)罕見或新的遺傳突變的可能性，為快速基因組測序或快速外顯子組測序的臨床應(yīng)用提供了機(jī)會。這在我們的研究中很容易看到，其中有幾個診斷病例非常罕見，甚至還沒有在OMIM中列出。我們先前的研究表明，超過90%的家庭在接受咨詢后會做出積極的生殖決策，例如產(chǎn)前診斷或胚胎植入前遺傳測試。

在考慮快速外顯子組測序的臨床效用時，還需要考慮所采用的測序技術(shù)的背景。離子通道快速外顯子組測序提供了單樣品運行和速度方面的靈活性和經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢。然而，本研究中使用的離子通道外顯子組展示了對插入缺失的敏感性降低，特別是在同源聚合性區(qū)域。因此，雖然這影響的病例數(shù)量很少，但這仍然是離子通道測序的一個嚴(yán)重限制，在應(yīng)用于這種情況時應(yīng)予以考慮。

從經(jīng)濟(jì)的角度來看，對于我們的患者群體，僅考慮年度醫(yī)療費用和程序費用（如肝臟或骨髓移植），快速外顯子組測序的應(yīng)用僅占總費用的很小一部分（1.27%）。然而，從罕見病患者的終身醫(yī)療費用的角度來看，快速外顯子組測序的費用相對較低，測試和臨床價值的證明被顯著放大。在本研究患者群中，應(yīng)用快速外顯子組測序所節(jié)省的醫(yī)療費用遠(yuǎn)超快速外顯子組測序費用。

 結(jié) 論 

這項研究顯示，在我們的親緣關(guān)系較近婚配人群中，快速外顯子組測序（RES）具有很高的臨床效用，使用了與之前在非親緣關(guān)系較近婚配人群中相似的定義。此外，我們強(qiáng)調(diào)了在這種特殊情況下的臨床效用的幾個獨特方面。我們希望我們的結(jié)果能夠增加支持將快速外顯子組測序作為急性病例的標(biāo)準(zhǔn)臨床檢測的證據(jù)。

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