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近日，《21羥化酶缺陷導(dǎo)致的先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥的實(shí)驗(yàn)室診斷共識(shí)》正式發(fā)布，進(jìn)一步規(guī)范了21-OHD的實(shí)驗(yàn)室診斷。《共識(shí)》高度肯定了三代CAH檢測(cè)技術(shù)。

01、21-OHD基因檢測(cè)難點(diǎn)

21-OHD是由CYP21A2基因的純合或復(fù)合雜合致病變異所致。CYP21A2 上游存在一個(gè)假基因CYP21A1P，真假基因外顯子序列的同源性高達(dá)98％，內(nèi)含子的同源性達(dá)96％。

由于假基因與CYP21A2 序列高度同源且位置相近，CYP21A2 的變異多來(lái)源于真假基因之間的重組或微交換。重組所產(chǎn)生的真假融合基因，可能體現(xiàn)為相應(yīng)真基因的不同范圍的缺失。不同的缺失導(dǎo)致的表型也有所差異，當(dāng)缺失范圍包含與CYP21A2 毗鄰的TNXB 基因時(shí)，會(huì)導(dǎo)致患者合并EhlersＧDanos綜合征。因此需對(duì)斷裂點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)檢測(cè)，以幫助預(yù)測(cè)表型。

實(shí)驗(yàn)室常采用Sanger測(cè)序+MLPA對(duì)21-OHD進(jìn)行分子診斷。但由于CYP21A2 基因的復(fù)雜性和技術(shù)局限性，仍然存在Sanger測(cè)序＋MLPA漏檢的可能性。二代測(cè)序技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)短片段(通常小于150 bp)的高通量測(cè)序，對(duì)序列特異性高的基因有較高的準(zhǔn)確性。

然而，對(duì)于CYP21A2 基因而言，由于存在同源度極高的假基因，在分析數(shù)據(jù)時(shí)無(wú)法區(qū)分短片段的來(lái)源，導(dǎo)致二代測(cè)序結(jié)果不可靠。但二代測(cè)序技術(shù)對(duì)于非21-OHD的CAH病例有進(jìn)一步鑒別診斷的作用。面對(duì)多個(gè)變異位點(diǎn)時(shí)，以上兩種解決方案都需要依賴家系驗(yàn)證來(lái)區(qū)分變異位點(diǎn)的順?lè)词疥P(guān)系。

02、三代測(cè)序CAH基因檢測(cè)優(yōu)勢(shì)

共識(shí)對(duì)三代測(cè)序在CAH檢測(cè)中的的優(yōu)勢(shì)進(jìn)行了全面闡述。三代測(cè)序技術(shù)克服了二代測(cè)序讀長(zhǎng)短的不足，測(cè)序最長(zhǎng)讀長(zhǎng)超過(guò)200 kb。其中PacBio測(cè)序平臺(tái)可通過(guò)對(duì)原始單分子模板(可達(dá)30 kb)進(jìn)行多次測(cè)序，矯正單分子隨機(jī)測(cè)序的錯(cuò)誤，獲得高準(zhǔn)確性的一致性序列，再結(jié)合高深度測(cè)序（多個(gè)單分子模板）獲得準(zhǔn)確的變異信息。

長(zhǎng)片段多重PCR技術(shù)可以擴(kuò)增CYP21A2、CYP21A1P 以及真假基因同源重組形成的基因缺失、基因重復(fù)和大片段基因轉(zhuǎn)換。三代測(cè)序可獲得每個(gè)PCR擴(kuò)增片段的完整序列，從而有效區(qū)分真假基因，并準(zhǔn)確地鑒定出點(diǎn)變異、Indel、缺失、重復(fù)和大片段基因轉(zhuǎn)換。

利用三代測(cè)序進(jìn)行21-OHD基因檢測(cè)具有以下優(yōu)勢(shì)：

利用同一反應(yīng)體系同時(shí)檢測(cè)CYP21A2 基因所有類型的致病變異，包括復(fù)雜基因重復(fù)和大片段的基因轉(zhuǎn)換；

可以準(zhǔn)確區(qū)分CYP21A2 和CYP21AIP，結(jié)果判讀直觀，不受真假基因同源性的干擾；

不依賴于家系基因型分析，可以直接分析兩個(gè)和多個(gè)變異之間的順?lè)词疥P(guān)系；

可對(duì)融合基因進(jìn)行一次性完整測(cè)序，能夠直觀地檢測(cè)出斷裂點(diǎn)。

03、實(shí)驗(yàn)室目的及適用人群

首先，明確21-OHD的診斷對(duì)CAH的及時(shí)治療、改善預(yù)后及遺傳咨詢至關(guān)重要。21-OHD的實(shí)驗(yàn)室診斷包括生化診斷和基因診斷。對(duì)于出現(xiàn)以下表現(xiàn)的患者，需要首先進(jìn)行生化檢查，結(jié)合臨床表現(xiàn)判定診斷的方向，最終進(jìn)行基因診斷。

圖2 診斷流程

21-OHD的生化診斷17α-OHP的水平檢測(cè)應(yīng)在清晨（上午８點(diǎn)前）進(jìn)行。對(duì)于育齡期女性，應(yīng)在卵泡期進(jìn)行類固醇激素的測(cè)量，其結(jié)果可能因檢測(cè)方法而異。經(jīng)典型21-OHD的患者，包括21-OHD的SW型和SV型，其未經(jīng)激發(fā)的17α-OHP值通常超過(guò)30nmol/L。需注意SV型和NC型的CAH患者17α-OHP水平可能難以區(qū)分。

圖3 適用人群

04、21-OHD的生化診斷

對(duì)CAH新生兒篩查陽(yáng)性或臨床高度疑似的患者，檢測(cè)其類固醇激素及其前體代謝物的水平是診斷CAH的主要手段。

圖4 生化診斷

05、21-OHD的基因診斷

01 診斷難點(diǎn)

21-OHD是由CYP21A2基因的純合或復(fù)合雜合致病變異所致，CYP21A2基因編碼21羥化酶（P450C21），并有一個(gè)高度同源的假基因CYP21A1P；真假基因外顯子序列的同源性高達(dá)98%；內(nèi)含子的同源性達(dá)96％，二者均定位于6p21.33區(qū)的HLA主要組織相容性復(fù)合體中。

圖5 真基因CYP21A2 和假基因CYP21A1P

造成的致病位點(diǎn)的差異

CYP21A2基因的變異類型變異包括錯(cuò)義、無(wú)義、剪接位點(diǎn)變異、小插入缺失（indel），而且真假基因會(huì)發(fā)生復(fù)雜的同源重組。

圖6 復(fù)雜的同源重組

02 致病性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

對(duì)于文獻(xiàn)中多次報(bào)道的致病變異以及在ClinVar等數(shù)據(jù)庫(kù)中被歸類為“致病”或“可能致病”的常見(jiàn)變異，無(wú)需進(jìn)一步評(píng)估其致病性。

對(duì)于其他變異，包括已被ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄但不太常見(jiàn)的變異，須參照美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）指南。

03 基因型-表型相關(guān)性

多數(shù)研究認(rèn)為，90％-95％的21-OHD患者的臨床表型與其所攜帶的CYP21A2的變異存在相關(guān)性。

04 基因診斷方法

要提醒注意的是，需明確CYP21A2基因有無(wú)致病變異，并明確攜帶致病變異的拷貝與正常拷貝在兩條等位基因上的分布情況，從而綜合判斷每條等位基因是否正常。

圖7 CYP21A2基因重復(fù)

對(duì)等位基因致病性判讀的影響

05 判讀錯(cuò)誤的原因及解決方案

① 等位基因脫扣。需使用多對(duì)覆蓋CYP21A2基因的引物對(duì)真基因進(jìn)行擴(kuò)增，確保不會(huì)因引物特異性問(wèn)題而導(dǎo)致漏檢；

② CYP21A2基因重復(fù)攜帶變異。重復(fù)拷貝若包含MLPA特異性結(jié)合位點(diǎn)的變異，可導(dǎo)致MLPA無(wú)法檢測(cè)出此重復(fù)。出現(xiàn)這種情況時(shí)，需仔細(xì)觀察測(cè)序峰圖，并結(jié)合MLPA的結(jié)果進(jìn)行判斷。

③ 漏檢雜合攜帶者。CYP21A2基因的拷貝數(shù)盡管為２，但兩個(gè)CYP21A2基因位于同一條染色體上，另一條染色體為CYP21A2基因完全缺失。此時(shí)需結(jié)合家系數(shù)據(jù)和單倍型分析對(duì)CYP21A2基因在兩條等位基因上的分布進(jìn)行準(zhǔn)確的分析；

④ 在某些情況下，真假基因重組形成的融合基因可能被同時(shí)擴(kuò)增，檢測(cè)到的致病變異可能被錯(cuò)誤地定位到功能基因上。此時(shí)需采用多對(duì)覆蓋CYP21A2基因的引物對(duì)真基因進(jìn)行擴(kuò)增，并結(jié)合家系數(shù)據(jù)和單倍型分析對(duì)融合基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行準(zhǔn)確的分析。

06、基于實(shí)驗(yàn)室診斷的遺傳咨詢

21-OHD的遺傳咨詢可通過(guò)對(duì)先證者進(jìn)行基因檢測(cè)，結(jié)合家族史，為患者家庭提供可能的疾病病程、家庭成員的遺傳狀況等信息。

圖8 實(shí)驗(yàn)室診斷的遺傳咨詢流程

07、鑒別診斷

在大規(guī)模篩查中，具有高17α-OHP水平的其他CAH疾病包括PORD、３β-HSD和11β-OHD。

圖9 CAH鑒別診斷

 結(jié) 語(yǔ) 

本共識(shí)建議應(yīng)重視并規(guī)范21-OHD的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，提供了各種生化及基因診斷方法的介紹及注意事項(xiàng)，并強(qiáng)調(diào)了基于實(shí)驗(yàn)室診斷的遺傳咨詢，希望本共識(shí)可為國(guó)內(nèi)同行提供參考。

參與本共識(shí)制定的人員，以單位和姓名為序

廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院（陳少科、范歆）；

廣州市婦女兒童醫(yī)療中心（黃永蘭）；

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院（鞏純秀）

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院（羅小平）；

三亞市婦幼保健院（王潔）；

南京市婦幼保健院（許爭(zhēng)鋒）；

上海市兒童醫(yī)院/上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院（鄒琳、李嬪）；

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國(guó)際和平婦幼保健院（王劍）；

復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院（王藝）；

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院（葉蕾）；

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院（梁黎黎、占霞、邱文娟、孫昱、余永國(guó)、顧學(xué)范）；

中南大學(xué)（鄔玲仟）；

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院（楊茹萊）；

參考文獻(xiàn)

中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志2023年7月第40卷第7期 ChinJMedGenet,July2023,Vol.40,No.7

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